Colorazioni

I preparati possono essere osservati a fresco  (per osservare forma, aggregazione, dimensioni, rifrangenza, motilità e riproduzione con tavolino riscaldato; eventualmente coloranti vitali debolmente tossici) oppure colorati (per osservare forma, stato di aggregazione, strutture accessorie, parete Gram, alcol-acido resistenza ecc).

I coloranti (colori di anilina) possono essere acidi (anionici) se ionizzano conferendo carica negativa alla porzione colorata, o viceversa basici (cationici) (più usati); per facilitare la fissazione dei coloranti si usano sostanze dette mordenzanti che li trasformano in complessi insolubili.

- goccia d'acqua sul vetrino, prelievo e stemperamento dello striscio;

- essiccamento all'aria del bunsen;

- fissazione a fiamma del bunsen (3 volte) (fissa il campione al vetrino per evitare che coi lavaggi e la colorazione venga perso, e rende i microrganismi più permeabili ai coloranti con la loro uccisione);

- colorazione;

- lavaggio;

- essiccamento;

- (olio di cedro);

- osservazione.

COLORAZIONE DI GRAM colorazione differenziale

a seguito della fissazione:

- cristalvioletto (o violetto di genziana) per 2' (il tempo dipende dalla concentrazione del colorante);

- rimozione dell'eccesso di colorante e aggiunta di liquido li lugol (mordenzante) per 2';

- lavaggio con acqua;

- decolorazione con soluzione di acetone - etere 50% per due volte;

- lavaggio con acqua;

- safranina (o fucsina basica) per 30-45'';

- essiccamento all'aria del bunsen;

- (olio di cedro);

- osservazione.

Gram + e Gram - vengono inizialmente colorati entrambi dal cristalvioletto e dal mordenzante in blu-viola-azzurro; dopodiché la decolorazione disidrata il peptidoglicano dei Gram +, provocando la coartazzione della struttura della parete e la chiusura dei pori; la parete è così resa impermeabile e il colorante rimane imprigionato nella cellula. I lipidi della parete dei Gram - vengono invece così sciolti, con il conseguente aumento della porosità della parete che causa la perdita del colorante e la facile colorazione con la safranina (rosa-fucsia), che invece non riesce a penetrare nei Gram +.

COLORAZIONE DI ZIEHL - NEELSEN colorazione differenziale

a seguito della fissazione:

- riscaldare la fucsina fenicata (fucsina basica + acido fenico) (colorante + mordenzante) fino ai primi vapori;

- colorare mantenendo la fucsina fenicata sul vetrino per 1';

- rimuovere il colorante in eccesso;

- decolorare con acido - alcol mantenendo sul vetrino per 1';

- lavare con acqua;

- colorare con blu di metilene, mantenedolo per 3-5' sul vetrino (a seconda della concentrazione del colorante);

- lavare con acqua;

- asciugare il vetrino;

- aggiungere una goccia di olio di cedro e osservare con obiettivo ad immersione 100X.

I micobatteri resistono alla decolorazione alcol-acida e rimangono colorati di rosa per la fucsina fenicata; tutte le altre cellule invece vengono decolorate e colorate dal blu di metilene (blu).

Terreni di coltura

MSA MANNITOL SALT AGAR
Terreno selettivo e indicativo; contiene infatti un'elevata concentrazione di NaCl (7,5%) che permette la crescita solo di specie alofile o alotolleranti, quali Stafilococchi.
Contiene inoltre mannitolo e rosso fenolo (indicatore di pH), permettendo così di distinguere le specie fermentanti questo zucchero (come S. aureus) da quelle che non lo fermentano (come S. epidermidis); la fermentazione del mannitolo produce infatti acidi che  colorano in giallo il terreno altrimenti rosso.
http://www.paramedical.it/metodiche/IT/PDL402290.pdf

MacCONKEY AGAR
Terreno selettivo e indicativo; contiene elevate concentrazioni di sali biliari e cristalvioletto che inibiscono la crescita delle specie Gram +, favorendo così quella dei Gram -.
Contiene inoltre lattosio e rosso neutro (indicatore di pH), permettendo così di distinguere le specie fermentanti questo zucchero (come E. coli) da quelle che non lo fermentano (es. Salmonelle); la fermentazione del lattosio produce infatti acidi che  colorano in rosso di varie sfumature le colonie che altrimenti apparirebbero incolori o rosine.
http://www.paramedical.it/metodiche/IT/PDL402240.pdf

EMB EOSINA E BLU DI METILENE AGAR
È un terreno selettivo per E. coli, contenente lattosio, e che fa apparire questo microrganismo in forma di colonie verdastre e fluorescenti (a scarabeo).
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/EMB.pdf

AGAR DI HEKTOEN
Terreno selettivo e indicativo; contiene elevate concentrazioni di sali biliari che svolgono l'azione inibente e tiosolfato e sali di ferro che evidenziano la presenza di batteri producenti H2S.
http://www.paramedical.it/metodiche/IT/PDL412230.pdf

SS SALMONELLA SHIGELLA AGAR
Terreno moderatamente selettivo e indicativo; contiene sali biliari, lattosio, un indicatore di pH, tiosolfato e sali di ferro. Inibisce la crescita di forme Gram +, ostacola quella di E.coli, permette di evidenziare la presenza di specie fermentanti il lattosio e di specie capaci di produrre H2S (che appaiono come colonie nere).
http://www.paramedical.it/metodiche/IT/PDO100360.pdf

LOWENSTEIN - JENSEN
Terreno selettivo e indicativo per micobatteri; contiene una miscela di soluzione tampone e giallo d'uovo, con eventuale aggiunta di fecola di patate. Può contenere verde malachite in varie concentrazioni per impedire lo sviluppo di specie microbiche contaminanti. Si aggiungono glicerolo per la crescita di Micobacterium tuberculosis, o piruvato per Micobacterium bovis.
http://www.paramedical.it/metodiche/IT/PDL30118.pdf

crescita di M. tuberculosis (A); M. bovis (B) e M. avium (C)










SABOURAUD'S DEXTROSE AGAR
Terreno selettivo per miceti (lieviti e funghi filamentosi o muffe); possiede un pH acido e contiene antibiotici per prevenire la crescita di specie batteriche; contiene destrosio-peptone.
http://www.paramedical.it/metodiche/IT/PDL10035.pdf

AGAR SANGUE
Terreno supplementato, costituito da terreno comune con l'aggiunta di sangue. Permette la differenziazione di Streptococchi in base alla loro attività emolitica:

- quelli beta-emolitici, quali S. pyogenes, provocano la lisi completa delle emazzie adiacenti alle colonie (dovuta alla produzione di sostanze quali la streptolisina O) con la formazione di un alone di beta-emolisi.

- quelli alfa-emolitici, quali S. viridans, provocano una parziale emolisi delle emazzie ed assumono una colorazione verdastra per la parziale riduzione dell'emoglobina liberata dalla lisi in metaglobina; formano quindi un alone di emolisi ristretta.

- quelli gamma-emolitici, quali S.faecalis, sono anemolitici e non provocano lisi delle emazzie (gamma-emolisi).
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/BLOOD%20AGAR%20BASE.pdf

A = gamma emolisi
B = beta emolisi
C = alfa emolisi














AGAR SIERO
Terreno supplementato con siero di sangue, possiede un'azione detossificante.

AGAR CIOCCOLATO
Terreno supplementato con sangue riscaldato, in modo da liberare principi nutritivi richiesti da specie particolarmente difficili da coltivare, quali Neisseria gonorrhoeae e Haemophilus influenzae.
http://www.paramedical.it/metodiche/IT/PDL10023.pdf

BRODO SELENITE E BRODO TETRATIONATO
Terreni elettivi per Salmonelle e Shigelle.
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/SELENITE%20BROTH.pdf

Brodo Selenite














http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/TETRATHIONATE%20BROTH%20BASE.pdf

Brodo Tetrationato















SIMMONS CITRATE AGAR
Terreno differenziale usato per valutare la capacità dei microrganismi di utilizzare citrato come unica fonte di carbonio; contiene infatti blu di bromotimolo (indicatore di pH) che in presenza di carbonati (basici) prodotti dal citrato fa virare la colorazione del terreno da verde a blu.
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/SIMMONS%20CITRATE%20AGAR.pdf

SIM MEDIUM
Terreno differenziale per evidenziare (S) la produzione di H2S da tiosolfato di ferro con conseguente annerimento, la produzione di indolo a partire da triptofano (aggiungendo cloroformio e paradimetilamminobenzaldeide che lo colora di rosso), e la motilità (infissione).
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/SIM%20MEDIUM.pdf

UREA
Terreno differenziale per osservare l'attività ureasica (microrganismi aventi ureasi). Contiene infatti urea e un indicatore di pH (rosso fenolo) che con la produzione di ammoniaca, che fa aumentare il pH, dovuta dell'attività ureasica, fa virare il colore del terreno da giallo a fucsia/rosso.
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/UREA%20AGAR%20BASE.pdf

MR-PV BROTH
Terreno liquido differenziale che consente di effettuare la prova del rosso metile e quella di Voges-Proskauer: dopo la coltura in tale terreno se ne trasferisce infatti una piccola quantità in una provetta piccola a cui si aggiunge rosso metile ed una quantità più cospiqua in una provetta più grande a cui si aggiungono idrato potassico e creatinina; si può così osservare se la specie in osservazione effettua una fermentazione acido-mista oppure una fermentazione glicolbutilenica, a seconda che risulti positiva la prima prova (provetta piccola, color rosa = fermentazione acido-mista) o la seconda  (provetta grande, colorazione rossa = fermentazione glicolbutilenica).
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/MR-VP%20BROTH.DOC.pdf

TSI TRIPLE SUGAR IRON AGAR
Terreno differenziale per i vari tipi di enterobatteri, contenente una miscela di peptoni, tiosolfato di sodio e sali di ferro, glucosio (1%), saccarosio e lattosio 10%) e un indicatore di pH (rosso fenolo). Il terreno viene fatto solidificare a becco di clarino e la semina del ceppo viene fatta per infissione nella porzione cilindrica (tubo) e per strisciamento sulla superficie del becco di clarino. Osservando così l'acidità (giallo) o basicità (rosso) del becco e del tubo, la produzione di gas, di H2S (nero) e la comparsa di eventuali altri pigmenti, si possono distinguere diverse specie di enterobatteri.
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/T.S.I.%20AGAR.pdf

PURPLE BROTH
Terreno differenziale liquido contenente un solo zucchero a scelta (1%), un indicatore di pH (bromocresolporpora), e una campanella di Durham; permette di giudicare l'avvenuta fermentazione dello zucchero con produzione di acidi (viraggio dell'indicatore da viola a giallo) ed eventualmente di gas (campanella).

TERRENO DI TRASPORTO STUART
Costituito da una soluzione tampone priva di carboidrati e peptoni per evitare che i microrganismi si replichino, in quanto esso costituisce un terreno di trasporto, atto a trasportare il campione, perchè rimanga invariato, dal luogo di prelievo al laboratorio. Gli viene aggiunto anche tioglicolato di sodio come agente riducente per favorire l'isolamento delle specie anaerobie.
http://www.paramedical.it/it/vario/batteriologia/STUART%20TRANSPORT%20MEDIUM.pdf