Colorazioni

I preparati possono essere osservati a fresco  (per osservare forma, aggregazione, dimensioni, rifrangenza, motilità e riproduzione con tavolino riscaldato; eventualmente coloranti vitali debolmente tossici) oppure colorati (per osservare forma, stato di aggregazione, strutture accessorie, parete Gram, alcol-acido resistenza ecc).

I coloranti (colori di anilina) possono essere acidi (anionici) se ionizzano conferendo carica negativa alla porzione colorata, o viceversa basici (cationici) (più usati); per facilitare la fissazione dei coloranti si usano sostanze dette mordenzanti che li trasformano in complessi insolubili.

- goccia d'acqua sul vetrino, prelievo e stemperamento dello striscio;

- essiccamento all'aria del bunsen;

- fissazione a fiamma del bunsen (3 volte) (fissa il campione al vetrino per evitare che coi lavaggi e la colorazione venga perso, e rende i microrganismi più permeabili ai coloranti con la loro uccisione);

- colorazione;

- lavaggio;

- essiccamento;

- (olio di cedro);

- osservazione.

COLORAZIONE DI GRAM colorazione differenziale

a seguito della fissazione:

- cristalvioletto (o violetto di genziana) per 2' (il tempo dipende dalla concentrazione del colorante);

- rimozione dell'eccesso di colorante e aggiunta di liquido li lugol (mordenzante) per 2';

- lavaggio con acqua;

- decolorazione con soluzione di acetone - etere 50% per due volte;

- lavaggio con acqua;

- safranina (o fucsina basica) per 30-45'';

- essiccamento all'aria del bunsen;

- (olio di cedro);

- osservazione.

Gram + e Gram - vengono inizialmente colorati entrambi dal cristalvioletto e dal mordenzante in blu-viola-azzurro; dopodiché la decolorazione disidrata il peptidoglicano dei Gram +, provocando la coartazzione della struttura della parete e la chiusura dei pori; la parete è così resa impermeabile e il colorante rimane imprigionato nella cellula. I lipidi della parete dei Gram - vengono invece così sciolti, con il conseguente aumento della porosità della parete che causa la perdita del colorante e la facile colorazione con la safranina (rosa-fucsia), che invece non riesce a penetrare nei Gram +.

COLORAZIONE DI ZIEHL - NEELSEN colorazione differenziale

a seguito della fissazione:

- riscaldare la fucsina fenicata (fucsina basica + acido fenico) (colorante + mordenzante) fino ai primi vapori;

- colorare mantenendo la fucsina fenicata sul vetrino per 1';

- rimuovere il colorante in eccesso;

- decolorare con acido - alcol mantenendo sul vetrino per 1';

- lavare con acqua;

- colorare con blu di metilene, mantenedolo per 3-5' sul vetrino (a seconda della concentrazione del colorante);

- lavare con acqua;

- asciugare il vetrino;

- aggiungere una goccia di olio di cedro e osservare con obiettivo ad immersione 100X.

I micobatteri resistono alla decolorazione alcol-acida e rimangono colorati di rosa per la fucsina fenicata; tutte le altre cellule invece vengono decolorate e colorate dal blu di metilene (blu).